全内反射荧光显微镜利用全内反射产生的隐逝波激发样品，从而使样品表面数百纳米内的荧光基团受到激发，产生荧光信号。因只有靠近样品表面区域产生荧光信号，全内反射显微镜技术极大的改善了图像的信噪比，从而可以观察到样品表面细节信号甚至单分子的活动情况。